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    CUT&Tag實驗中,Protein A/G的巧妙選擇

           CUT&Tag技術中,利用一抗特異性靶向目標蛋白質,之后利用二抗識別一抗來放大信號。隨后,含有pA/G-Tn5的轉座酶來識別二抗,最后轉座酶在結合位點處切割DNA,留下Tn5的核心序列粘貼在切割的DNA處。最后純化DNA后,利用含有Tn5核心序列的接頭進行PCR擴增最終獲得我們需要的結合DNA的文庫。

     

            那么,一抗、二抗和protein A/G之間的巧妙安排又是何原理呢?

     

           人工制備的一抗,主要是依賴特異性抗原免疫動物而獲得,所以目的蛋白對應抗體能夠識別目的蛋白。而二抗制備,是利用抗體免疫異種動物,由異種動物的免疫系統產生的針對于此抗體的免疫蛋白。二抗針對某一特定物種的所有抗體(如IgG、IgM或IgA等)均具有反應性。意思就是,如果使用來源于兔源的一抗,那么選擇抗兔的二抗即可識別該一抗;使用來源于鼠源的一抗,那么使用抗鼠的二抗即可識別該一抗。

     

           CUT&Tag實驗中,推薦使用抗IgG H&L的二抗,它是最常用也是性價比最高的二抗形式。這類抗體和IgG分子的重鏈和輕鏈都可以反應,也可以和其他的免疫球蛋白家族(IgM,IgA,IgD,IgE)和亞家族反應,因為所有的免疫球蛋白都有相同的輕鏈(但是在使用單克隆抗體時,需要選擇與一抗的類別或亞型相匹配的二抗)。同時,還需要要求二抗不帶耦聯標記(即二抗不能偶聯任何標記,HRP、FITC等都不行)。

     

           在細菌表面可分泌表達特殊功能蛋白與免疫球蛋白特異結合,主要分為Protein A金黃色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal proteinA, SPA)、Protein G鏈球菌G群的細胞表面蛋白 G(Streptococcal protein G, SPG)和Protein L大消化鏈球菌蛋白L(Peptostreptococcus protein L, PPL),三種均為典型的免疫球蛋白結合蛋白。重組蛋白Protein A由大腸桿菌表達體系獲得,由5個IgG 結合結構域E-D-A-B-C串聯排列組成,對IgG的Fc片段具有很強的特異性親和力。重組蛋白Protein G從大腸桿菌表達體系中獲得,含有3個IgG 結合區。為確保 IgG 的最大特異性結合,重組蛋白Protein G 中細胞壁結合區、細胞膜結合區和白蛋白結合區已被去除,減少了交叉反應和非特異性結合。重組蛋白Protein A/G在大腸桿菌中產生,由7個IgG 結合結構域EDABC-C1C3組成,對應于5個Protein A的IgG結合區和2個Protein G的IgG結構域。重組蛋白Protein A/G 的結合能力比單獨的蛋白A或蛋白G更廣。因此,現在CUT&Tag實驗中,普遍使用Protein A/G-Tn5來進行靶向切割實驗。


    1.Protein A、G親和性

             
           Protein A/G可以與一抗的FC區域結合,也可以與二抗的FC區域結合。CUT&Tag實驗中,主要是希望Protein A/G結合二抗達到信號放大。翌圣CUT&Tag試劑盒,將二抗提前與pA/G-Tn5進行孵育,減少了pA/G-Tn5與抗體未識別偶聯而產生的非特異切割。同時,CUT&Tag實驗時長因此步驟的改變而縮短至6 h。

            這樣巧妙的靶向原理
    get到了么? 



    翌圣CUT&Tag試劑盒優勢


    1.翌圣CUT&Tag試劑盒優化了實驗體系,使用protein A/G增加抗體特異識別之外,將二抗與protein A/G提前孵育,減少了非特異切割,同時實驗時長縮短至6 h;

    2.添加spike in,讓你的實驗結果更真實,更準確。



     


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    圖5.Spike in校正后,更能反映數據的真實性

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    圖6.Spike in校正后,基因富集更明顯


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