透過《體外診斷試劑分析性能評估體系指導原則》看IVD原料的核心品質
2019年國家藥監局發布的《醫療器械注冊工作》中醫療器械注冊申請共計5877項，體外診斷試劑注冊申請共計3227項。而2018年的體外診斷注冊申請僅817項，特別地在今年新冠疫情中對于體外診斷的需求也刺激了體外診斷市場不斷擴張。
圖1. 2017年至2019年體外診斷試劑注冊項目回顧體外診斷試劑產品的注冊過程中要求提供申報產品的分析性能評估資料，產品性能評估是產品研發、制定產品標準等過程的重要技術支持研究過程，并可能對產品的質量造成一定的影響。面對不斷增加的體外診斷試劑的需求，如何對有效對診斷試劑進行系統的評估尤為重要。目前國際上對體外診斷試劑的性能評估通常是以美國臨床實驗室標準化組織（Clinical
and Laboratory Standards
Institude以下稱為CLSI）的相關標準為依據，也是美國FDA推薦采用的評價標準，但我國還沒有相關的標準及指導原則的要求。在國家藥監局發布的《診斷試劑體外診斷試劑分析性能評估體系指導原則（征求意見稿）》中提出了為進一步明確體外診斷試劑分析性能評估的技術要求，以明確體外診斷試劑產品性能評估的技術要求。體外診斷試劑產品性能評估包括檢測限、線性范圍、可報告范圍、準確度（回收實驗）、準確度（方法學比較）、精密度、干擾實驗、穩定性、參考區間共九個項目。檢測限（limit
of detection）是指檢測方法可檢測出的最低被測量濃度，也稱檢測低限（lower limit of
detection）或最小檢出濃度（minimum detectable
concentration），有時也稱為分析靈敏度（analytical sensitivity）精密度是衡量體外診斷試劑批內和批間變異的重要指標，通常包括批內和批間不精密度。干擾物質是體外診斷試劑使用過程中造成測量誤差的一個主要原因，針對體外診斷試劑進行的干擾實驗是指通過實驗查找出對體外診斷試劑測量結果產生影響的物質的過程。干擾實驗評估資料是評價擬上市產品有效性的重要依據，也是產品注冊所需的重要申報資料之一。穩定性評估資料是評價擬上市產品有效性的重要依據，其中包括對于儲存穩定性、開瓶穩定性、運輸穩定性進行探討。
Hieff? Direct Taq DNA Polymerase（5U/μL）（Cat：10709ES）
高純度：純度>95%，無核酸酶殘留，宿主gDNA殘留量低
良好的批次穩定性：嚴苛的生產流程和質檢標準，保證不用批次產品性能穩定性
穩定的生產產能：大規模生產體系，單批次產能達g級；穩定供應，貨期短
圖2. 上樣量1-5 μL，經SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色，Hieff? Direct Taq DNA Polymerase 純度大于95%。圖3. 50 μL反應體系中，加入10U Hieff? Direct Taq DNA Polymerase，與500 ng λ DNA/Hind III酶切產物，在37℃孵育4h，酶切產物帶型無變化，無核酸酶殘留。
圖4. 10μl反應體系，取10U非熱啟動Taq酶，與500ng IL23R 超螺旋質粒在37℃孵育4h；電泳觀察帶型變化。結果顯示無切口酶殘留，表明本品無切口酶殘留。表1. 磷酸酶活性（pNPP，緩沖液）-200 μL的反應緩沖液含1 M二乙醇胺 、0.5 mM MgC12、2.5 mM對硝基苯磷酸鹽（pNPP）以及至少40 μL標準Taq（不含Mg2+）；通過分光光度法測定并且在37 ℃下4小時可產生<0.0001單位的堿性磷酸酶活性。10U三批次D-Taq酶磷酸酶殘留均小于0.0001U。
酶 | 用量 | 37度反應起點OD405 | 37度4小時終點OD405 |
磷酸酶 | 0.001U | 0.167 | 2.798 |
磷酸酶 | 0.0001U | 0.132 | 1.111 |
磷酸酶 | 0.00001U | 0.13 | 0.246 |
磷酸酶 | 0.000001U | 0.134 | 0.158 |
磷酸酶 | 0.0000001U | 0.126 | 0.142 |
T19D20C0401 | 10U | 0.117 | 0.123 |
T19D20E1301 | 10U | 0.13 | 0.138 |
T19D20G0301 | 10U | 0.13 | 0.136 |
Taq buffer | 2ul | 0.128 | 0.135 |
blank |
| 0.114 | 0.129 |
表2. 將待檢酶94℃加熱30min、60min之后測定酶活。94℃加熱1小時仍具有不低于50%的酶活。
| 94℃ |
加熱時間 | 0min | 30min | 60min |
酶活 | 100% | 87% | 50.60% |
圖6. 50 μL體系中，加入2U的酶，以無菌ddH2O為模板，擴增E.coil 16s rDNA基因。35個循環后擴增產物進行1% 瓊脂糖凝膠電泳，EB染色。無擴增條帶。Uracil DNA Glycosylase (UDG/UNG), heat-labile（Cat：10303ES）10U熱敏UDG中大腸桿菌基因組殘留低于10拷貝
無核酸酶殘留
尿嘧啶是此酶識別的唯一堿基
圖7. 上樣量為5-20 μL，經SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色，純度大于95%。
圖8. 在50μL反應體系，取1U酶，與500ng lambda DNA/Hind III酶切產物在37℃孵育4h；電泳觀察帶型變化。結果顯示帶型及條帶深淺與對照一致，無核酸酶殘留。
圖9. 在10μL反應體系，取1U酶，與500ng IL23R 超螺旋質粒在37℃孵育4h；電泳觀察帶型變化。結果顯示，帶型及條帶深淺與對照一致，無切口酶殘留。圖10. 10μl反應體系，取1U酶，與500 ng 293T RNA 在37℃孵育4h；電泳觀察帶型變化，與陰性帶型一致-合格。Hifair? V Reverse Transcriptase （Cat：11300ES）Hifair? V Reverse Transcriptase 是在 Hieff? M-MLV (H-) Reverse Transcriptase 基礎上通過基因工程技術得到的逆轉錄酶，與 Hieff? M-MLV (H-) Reverse Transcriptase 相比，其熱穩定性大幅度提高，可耐受高達 60℃的反應溫度，適合具有復雜二級結構的 RNA 模板的逆轉錄。同時，該酶增強了與模板的親和力，適合少量模板以及低拷貝基因的逆轉錄。Hifair? VReverse Transcriptase 合成全長 cDNA 的能力也有了提升，可擴增長達 10 kb 的 cDNA。產品特點
兼容性：適合不同GC含量、不同表達豐度基因逆轉錄
靈敏度高
圖11. 上樣量2 μg，經SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色，根據條帶分析純度。純度大于95%。圖12.在200 U本酶和1 μg Supercoiled pBR322 DNA，37℃下孵育1 h，結果顯示無核酸內切酶殘留。在200 U本酶和1 μg λDNA-Hind Ⅲ，37℃下孵育1 h，結果顯示DNA的電泳譜帶不發生變化，無核酸外切酶殘留。圖13. 在10μl反應體系，取1000U 反轉錄酶，與500ng IL23R 超螺旋質粒在37℃孵育4h。結果顯示電泳觀察帶型，無變化無切口酶殘留。圖14. 在50 μL體系中，加入200U的酶，以無菌ddH2O為模板，擴增E.coil 16s rDNA基因。35個循環后擴增產物進行1% 瓊脂糖凝膠電泳，EB染色。結果顯示無擴增條帶即無大腸桿菌基因組殘留。
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